北京凯吉特医药

 

附表：

 

 

一、适用范围

2019新型冠状病毒核酸检测试剂用于对咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等样本中的2019新型冠状病毒核酸进行体外定性检测。本审评要点适用于进行首次注册申报的产品。

二、性能评估：

企业应提交在符合质量管理体系的生产环境下生产的试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、实验方案、实验数据、统计分析等详细资料。建议着重对以下分析性能进行研究。

1.核酸（RNA）提取/纯化性能

在进行靶核酸检测前，应有核酸（RNA）提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的RNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有RNA分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸提取试剂/方法的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，提供详细的验证资料。

2.最低检测限

（1）最低检测限的确定

将含有2019新型冠状病毒的真实临床样本/含有该病毒RNA片段的假病毒颗粒梯度稀释于（与适用样本一致的）适当基质中，用于进行最低检测限研究，应采用科学的方法标定病毒滴度。每个浓度梯度最少重复三次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样品，每个浓度至少重复20次检测，将具有90%～95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的最低检测限。

在进行最低检测限的确定时，应至少包括不同来源的三个具有代表性的2019新型冠状病毒样本，进行系列梯度稀释。

（2）最低检测限的验证

选择不同来源的至少3个病毒样本（与最低检测限确定不同的病毒样本）在最低检测限浓度水平进行验证，应达到90%～95%阳性检出率。

应提供详细的病毒液滴度的确定方法及验证结果。

3.不同区域病毒样本包容性的验证

至少验证包括具有时间和区域特征性的10个不同来源的病毒样本（阳性临床样本或分离培养物），应包括最低检出限、重复性等性能的验证，病毒样本的滴度应采用科学合理的方法进行标定。

4.分析特异性

（1）交叉反应验证包括：

①地方性人类冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒；

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D组，人间质肺病毒、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒；

肺炎支原体、肺炎衣原体；

军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌；  

烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌等。

建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的浓度水平为10⁶ cfu/ml或更高，病毒为10⁵ pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。

②人类基因组DNA。

（2）内源/外源物质干扰

应根据所采集样本类型，针对可能存在的干扰情况进行验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，在病毒临界阳性水平进行干扰试验验证。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质（如血液、鼻腔分泌物、粘液及用于缓解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和过敏症状的鼻腔和咽喉药物、抗菌药物、抗病毒药物等）及在样本采集和制备期间引入的物质。

表1 推荐用于干扰试验的物质

物质	活性成分
粘蛋白	纯化粘蛋白
血液（人类）
鼻腔喷雾剂或滴鼻剂	苯福林、羟甲唑啉、氯化钠（含防腐剂）
鼻用皮肤类固醇	倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松
过敏性症状缓解药物	盐酸组胺
抗病毒药物	α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、阿比多尔
抗生素	左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢曲松、美罗培南
全身性抗菌药	妥布霉素

5.精密度

企业应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。模拟样本并不能体现临床样本可能带来的所有变异因素，因此精密度评价中应同时包含若干临床样本，且精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。

（1）对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除检测试剂（包括核酸分离/纯化组分）本身的影响外，还应对分析仪、操作者、地点、检测轮次等要素进行相关的验证。

（2）设定合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的检测或者为期至少5天的检测，具体方案可参考EP文件进行。从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

（3）用于精密度评价的人工模拟样品和临床样本均应至少包含3个水平：阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根据产品特性设定适当的精密度要求，临床样本精密度评价中的每一次检测均应从核酸提取开始。

①阴性样本：待测物浓度低于最低检测限或为零浓度，阴性检出率应为100%（n≥20）。

②临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应≥95%（n≥20）。

③中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且CV≤10%（n≥20）。

6.提供企业参考品验证资料：根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的实验数据。

7.其他需注意问题

对于适用多个机型的产品，应提供产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。不同样本类型应分别进行性能评估验证.

三、注册检验

应提供符合产品技术要求的、在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行的产品检验报告，应提供连续3个生产批次样品的检验合格报告。

该项目已有国家参考品，应使用国家参考品进行注册检验。

四、阳性判断值确定资料

阳性判断值确定资料主要指对申报产品病毒核酸检测的Ct值，即结果判断的临界值进行确认的资料。阳性判断值研究资料样本来源应考虑不同年龄、性别、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。应说明所选择阳性判断值研究方法的合理性，阈值设置应科学合理。提供内标值的确定方法和研究资料。

五、主要原材料研究资料

此产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、质控品、参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量标准等相关研究资料、质控品的定值试验资料等。如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应提供资料包括：选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。

1.引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、靶序列的基因位点及两者的对应情况。建议每种病毒设计两套或多套引物、探针以供筛选，通过序列比对和试验等方式，对病毒进行包容性和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。

2.脱氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，应提供对其纯度、浓度、功能性等的详细验证资料。

3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，应分别对酶活性、功能性等进行评价和验证。

4.试剂盒内质控品

试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现，其应参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程。以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。申报资料应对试剂盒质控品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料详细说明。企业应对质控品的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。

4.1阴性质控品应不含试剂盒所检测的靶序列。

4.2阳性质控品

阳性质控品可用1～2个病毒株为代表，应含有天然的或人工合成的包含试剂盒可检测靶序列（如假病毒）。

 5.内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求。建议科学设置内对照（内标），对待侧样本的取样质量、试剂的反应体系进行监控。

6.企业参考品

应根据产品性能验证的实际需要自行设定企业内部参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、重复性参考品。

阳性参考品应着重考虑不同来源的病毒样本和滴度要求，应至少选取不同来源的5个病毒样本。

阴性参考品则主要涉及对交叉反应的验证情况，建议包括冠状病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠状病毒（可采用假病毒）、MERS冠状病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

检测限参考品的浓度水平可采用90～95%阳性检出水平或略高于最低检测限的水平，如100%阳性检出水平。检测限参考品的浓度确定应科学合理。

重复性参考品建议包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为最低检出限附近的浓度。

申请人应对内部参考品的来源、型别鉴定、病毒滴度等信息进行精确的试验验证，并提交详细的验证资料。

六、主要生产工艺及反应体系的研究资料

1.介绍产品主要生产工艺，可用图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。

2.反应原理介绍。

3.详述样本采集、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。

（1）研究样本采集时间点的选择：是否受病程、临床症状、用药情况等因素的影响。

（2）研究对采样拭子及样本保存液的要求：对采样拭子的材质要求（包括对拭子头和拭子杆的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、浓度、使用量的要求等。

4.确定最佳反应体系的研究资料，包括样本用量、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。建议在保证核酸提取纯度的情况下尽量扩大总反应体系和加样量。

5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。

6.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。

七、稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。

1.申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

2. 适用样本的稳定性

考虑到病毒RNA极易被降解的特性，企业也应对样本稳定性进行研究，包括采集后未经处理的样本，加入裂解液/保存液的样本，常规病毒灭活的样本，保存条件包括冷藏和冷冻两种条件。如产品适用拭子、痰液和灌洗液等不同的样本类型，因其中干扰物质存在较大差异，可能对病毒RNA降解的影响不同，建议对每种样本类型均进行研究。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

对于此类试剂，如核酸提取液不能立即进行检测，则还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。

八、临床证据

新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂临床试验应按要求在三家以上临床试验机构进行（含各级疾病预防控制中心），通过考核试剂对来自临床病例样本的检测结果与已上市同类产品检测结果以及病例的临床确诊/排除结果进行对比，以验证产品临床性能。已上市同类产品检测结果可获取自病例临床诊疗过程。如临床试验机构条件允许，推荐多家生产企业的试剂盒在相同的临床试验机构共同验证。

1.临床试验对比方法

临床试验应选择已上市的同类产品作为对比产品，同时，考虑考核试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行对比。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊断方案》及《全国各省（区、市）首例新型冠状病毒感染的肺炎病例确认程序》等文件，病例确认方法应依据上述文件中规定的各省份首例病例确认程序及各省第二例及以后的感染病例的确认程序制定。不建议采用某一试验地点的单次试验结果作为确认结果。既往病例的确认结果可提交该病例的既往确认数据。

2.临床试验入组人群

临床试验的入组人群应为产品的预期适用人群，该产品的适用人群为新型冠状病毒感染肺炎的疑似病例，国家卫生健康委在不同时间阶段发布了不同版本的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，申请人在进行临床试验时应考虑当时现行方案对“疑似病例”的定义，按照该定义入组病例进行临床研究，临床试验过程中应包括确诊及排除病例。临床试验中应入组部分前期新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测阴性的确诊病例，该部分病例可采用回顾性研究，临床验证的样本包括：前期核酸检测剩余样本及病例确认所用样本。同时，临床试验还可入组部分解除隔离和符合出院标准的病例，该部分病例阴性的确认应满足现行的《新型冠状病毒感染的肺炎诊断方案》中关于解除隔离和出院标准的要求。

3.临床试验样本类型

试剂盒样本采集建议按照《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》进行。临床试验过程中，如临床试验过程中样本确实难以获得，经提取后的核酸提取液亦可作为样本进行临床试验。如采用核酸提取液进行临床试验，建议临床试验中明确该核酸提取液对应的样本类型及样本保存液/采样液（如适用），同时明确核酸提取试剂盒，临床前应对临床试验中所涉及的样本类型、样本保存液及核酸提取试剂进行充分的性能评估，临床试验中所用样本保存液及核酸提取试剂应严格满足考核试剂及对比试剂要求。

临床试验中如病例可获得多个样本类型，如上、下呼吸道标本等，验证过程中建议至少包括上呼吸道样本和下呼吸道样本。临床试验不同样本类型及核酸提取液稳定性应满足考核试剂及对比试剂的要求。

4.临床试验样本量

新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂为定性产品，临床试验过程样本量应能够满足评价临床评价指标的要求，如临床灵敏度、临床特异度、阴阳性符合率等，建议入组确诊病例不少于200例，排除病例不少于300例，同时入组部分解除隔离和符合出院标准的病例。入组病例中不同临床严重程度、不同病程阶段的患者均应有一定的例数。如申报试剂包含不同样本类型，建议每种样本类型单独统计满足统计学要求。

5.临床试验结果的统计分析

此类产品的临床试验目的在于验证申报产品与临床已应用的同类产品及临床参考标准的一致性，统计分析一般以2×2表的形式对结果进行总结，并据此计算申报产品与对比产品的符合率、临床灵敏度、临床特异度及其置信区间。应将考核试剂与对比试剂检测结果一致性及考核试剂检测结果与临床确认/排除结果的一致性分别进行统计分析，以评价产品临床性能。

临床试验建议对入组人群的人口学进行分析，包括年龄、性别、临床诊断背景、临床分型等。临床试验中应对不同的人群进行分层统计，如确诊/排除病例、前期新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测阴性的确诊病例、及解除隔离和符合出院标准病例等。针对前期新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测阴性的确诊病例前期阴性样本、及解除隔离和符合出院标准病例样本，应描述考核试剂针对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检出率。临床试验中包含不同样本类型的，应在总样本数（各样本类型总和）进行统计分析的基础上，每个样本类型分别进行统计分析。

临床试验中所有不一致结果均应结合患者的流行病学背景、临床症状、疾病转归等信息进行充分的分析。

6. 临床证据的形式要求

申请人应按照《体外诊断试剂注册管理办法》、《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等法规文件要求提交各机构伦理审查意见、临床试验方案和临床试验报告以及临床试验总结报告。

临床试验数据汇总表作为临床试验报告的附件提交。数据表中应包括检测病例的编号、年龄、性别、样本类型、临床诊断背景信息、考核试剂检测结果（含各基因的Ct值）、对比试剂的检测结果（各基因的Ct值）、新冠病毒感染的确诊或排除结果等，如临床试验中所用样本为核酸提取液，应明确该样本样本保存液（如涉及）、核酸提取试剂等。临床应用的数据集中每一病例编号应能够溯源。具体内容详见附表。